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胚胎冷凍發展歷史
冷凍技術之發展起源很早，1776年義大利學者Lazzaro Spallani無意間觀察到種馬取出之精液在冬天結凍後再溶化時，有些精子可以恢復其活動能力。一七八○年代之後，冷凍方法就被應用於動物精液之保存。
由於胚胎細胞體積較精子大得多，且含有較多的水分，因此冷凍技術上較困難。動物胚胎冷凍保存之研究起步於一九五○年代之後。學者們發現冷凍時溫度下降之速度、冷凍保護劑加入時之方法及濃度、讓胚胎細胞結冰之溫度，以及解凍時溫度上升之速度，均會影響到胚胎之存活率。哺乳類動物胚胎的冷凍保存,在1976年由Wilmut和 Whittingham發展成功,他們將早期的老鼠胚胎用DMSO (Dimethyl Sulphoxide)做為冷凍保證劑( cryoprotectant) ,以慢速冷凍和慢速解凍的方式得到存活的老鼠胚胎,並植入子宮內發育至成體。澳洲的Trouson和Mohr在1983年將此種慢速冷凍技術修改後，成功的應用到人類的胚胎上,並產下世界上第一位冷凍胚胎試管嬰兒，亦是第一個經由冷凍保存技術誕生之靈長類動物。自此以後,冷凍胚胎的技術便日漸普遍的應用在人工生殖技術上。

胚胎冷凍保存的必要性
一般在做試管嬰兒療程時，為了要提高懷孕成功率，首先我們會以排卵藥物來刺激更多卵巢濾泡生長，以便取得較多數目的卵子，體外授精後可以得到較多的胚胎來植入。一般來說植入的胚胎數目越多，懷孕的成功率越高，但是多胞胎妊娠的機率就相對增加了。如果懷三胞胎以上，則發生流產或早產的機會甚高，到最後可能得不償失。因此，為了要減少多胞胎之發生率，同時又不影響懷孕之成功率，我們將植入之胚胎限制在二到五個(依病患年齡)，那麼多餘的胚胎就需靠冷凍技術來加以保存了。如果病人幸運在治療週期懷孕了，那麼冷凍胚胎可以留到將來想要再懷孕時使用；如果病人在治療週期沒有成功，則保存的胚胎可以在下個週期植回母體內。如此一來除了可以增加病人的累積懷孕機率外，更可以減少病人重覆實施取卵手術之次數及金錢上的負擔。此外，在合法管道下多餘的胚胎也可以捐贈給其他不孕症夫婦幫助他們受孕，或是用來發展胚胎著床前診斷技術、胚胎幹細胞研究以及基因治療等新的生殖科技。

胚胎冷凍的方法

1. 慢速冷凍法:
   慢速冷凍法的原理合乎冷凍生物學的原理,所|以被大多數的實驗室所採用。由於胚胎細胞內含有大量的水分，這些水分在冷凍時會形成冰的結晶體而造成細胞的破壞，因此在冷凍前需先進行細胞脫水。但是當細胞脫水時，細胞內溶質的濃度亦相對增高，這對於細胞會造成不利的影響。因此，冷凍之前的胚胎要浸泡在含有蔗糖、甘油、DMSO等冷凍保護劑中。這時不要一下子就使用高濃度的保護劑，要慢慢增加濃度。在胚胎和冷凍保護劑達成平衡後，以電腦控制的冷凍儀讓胚胎的溫度緩慢的下降至攝氏零下30度左右，然後再保存於攝氏零下196度之液態氮中，就可以長期保存。在解凍時取出吸管加熱，用與冷凍時相反的步驟，放回培養液中。此一方法冷凍胚胎之存活率可以高達75至85%。
   
2. 超快速冷凍法(Ultrarapid freezing) :
   因為慢速冷凍法的過程需要花費3至4小時，而且需要昂貴的冷凍儀器,所以研究人員希望能找出更簡單迅速的冷凍方式。超快速冷凍法主要是藉著高濃度的冷凍保護劑使細胞快速脫水後，在零度下三分鐘即放入液態氮中瞬間冷凍。雖然這種超快速冷凍的方法簡單且節省時間,但目前使用這種方法冷凍人類胚胎的存活率及成功率仍然偏低,最近已漸漸由玻璃化方法( vitrification)來取代。
   
3. 玻璃化方法(Vitrification) :
   利用高濃度（比超快速冷凍法的冷凍保護劑濃度更高）的冷凍保護劑含DMSO 或EG (Ethylene Glycerol) ，將細胞內水份脫水至細胞外,然後直接將胚胎置入攝氏零下196度的液態氮中，細胞內的物質瞬間變成高黏稠固態的玻璃狀物質，細胞內冰晶來不及形成就被冰凍起來。解凍時直接將含胚胎的小管置入攝氏37度的水槽內解凍，然後再分2至3個步驟將冷凍保護劑從細胞內移出至細胞外。整個過程不必使用電腦控制的冷凍儀，可節省3小時操作時間。玻璃化方法( vitrification)高濃度的冷凍保護劑對於細胞仍有毒性。1999年Lane提出冷凍環(cryoloop)的方法，提高冷凍的速度及減少冷凍保護劑的體積，有效降低冷凍保護劑毒性對於胚胎的影響。利用cryoloop的方法，Mukaida於2001報告有60個人類囊胚被玻璃化冷凍，解凍後有38個 (60.0%) 囊胚存活。植入於19位患者,有6位患者懷孕成功 (31.6%)，已達實用階段 （圖）。

響冷凍胚胎懷孕成功率的因素:

1. 胚胎分裂時期
   因為2細胞、4細胞和8細胞的胚胎處於細胞分裂週期的間期(interphase) 所以細胞較為穩定,比較不容易受到冷凍的傷害。所以這些時期的胚胎比較適合冷凍保存。
   
2. 胚胎冷凍前的品質
   在冷凍前胚胎若無碎片存在並且細胞透明而對稱,表示胚胎的品質較為良好,則解凍後的懷孕率較高。
   
3. 冷凍與解凍的技巧
   目前以慢速冷凍的方法較合乎冷凍生物學的原理,所以成功率最高。但是利用Cryoloop的玻璃化方法快速省時，實用性很高。
   
4. 冷凍胚胎的植入數目
   解凍後的胚胎數目若多於3個,植入後的懷孕率明顯地高於只植入l個至2個胚胎。
   
5. 年齡
   解凍後的胚胎存活率不受年齡的影響，但是年齡小於35歲的年輕病患,在解凍胚胎植入後有較高的臨床懷孕率。
   
6. 植入的時機
   四細胞的胚胎應該在排卵後的72小時解凍，並且在隔天細胞分裂後植入；八細胞的胚胎應該排卵後72小時解凍,並在當天植入；囊胚期的胚胎應該在排卵後第5天解凍,並在當天植入。
   
7. 胚胎冷凍保存的時間
   胚胎冷凍保存的時間長短，並不會影響懷孕率。

結論
人類冷凍胚胎的發展歷史只不過23年，到目前為止各種快、慢速冷凍法仍舊在發展當中，無非是希望找到最合適的冷凍及解凍方法，希望解凍後能得到最好的存活率及懷孕率。國內第一例冷凍試管嬰兒於1989年在台大醫院誕生，之後國內各大醫學中心包括國泰綜合醫院也先後發表成功懷孕的例子，而且最重要的是所出生的嬰兒，先天畸形的機率並不比自然懷孕出生的嬰兒高。筆者前年至美國進修時亦習得玻璃化冷凍環技術，此項最新冷凍技術的引進運用，將嘉惠更多不孕症病患。